<< Главная страница

ГЛАВА
          1

МЕТОДЫ И МАРКЁРЫ






Арсенал методов гистологии, эмбриологии и цитологии включает (наряду с классической гистологической техникой) методы исследования структуры и функции клетки, применяемые в клеточной биологии. В главе дан краткий обзор методов (собственно гистологическая техника, гистохимические и цитохимические методы, культивирование in vitro, цитофотометрия, радиоавтография, различные маркёры).

ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

Основные типы материала для микроскопии – срезы, мазки (гематологические [например, крови и красного костного мозга] и гинекологические [например, ПАП-мазки]), мазки-отпечатки (например, слизистой оболочки щеки для определения тельца Барра), сколы, смывы.

Фиксация

Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путём их химического сшивания.

Фиксирующая жидкость. Быстрое проникновение химического фиксатора в живую ткань – условие сохранности структур in situ. Наиболее распространённые фиксаторы – формалин, спирты, глутаральдегид. Небольшие кусочки ткани фиксируют, помещая их в раствор фиксатора. Целые органы перед выделением перфузируют, т.е. прокачивают фиксатор через сосудистую систему органа.

Криофиксация. Лучшую сохранность структур обеспечивает мгновенное замораживание образцов в жидком азоте (–196 °С).

5

Лиофилизация – один из способов подготовки материала как для СМ, так и для ЭМ. Небольшие кусочки ткани подвергают быстрому замораживанию, прекращающему метаболические процессы. Последующее высушивание в вакууме вызывает возгонку льда. Метод позволяет исключить обработку ткани в промежуточных средах (обезвоживание и заливка).

Обезвоживание

Обезвоживание готовит фиксированную ткань к проникновению в неё сред для заливки. Вода живой ткани, а также вода фиксирующих смесей (большинство фиксаторов – водные растворы) после фиксации должна быть полностью удалена. Стандартная процедура удаления воды – обезвоживание в спиртах возрастающей от 60° до 100° крепости.

Заливка

Заливка – необходимая процедура, предваряющая приготовление срезов. Заливка делает ткань прочной, предотвращает её раздавливание и сминание при резании, даёт возможность получить тонкие срезы стандартной толщины. Наиболее распространённая среда для заливки – парафин. Используют также целлоидин, пластические среды и смолы.

Приготовление срезов

Микротом. Серийные и отдельные срезы различной толщины и площади для СМ готовят при помощи специального устройства – микротома (рис. 1-1). Стальной нож микротома позволяет получить срезы толщиной 3–8 мкм из залитых в парафин, целлоидин или полиэтиленгликоль кусочков ткани. Стеклянные или алмазные ножи

Рис. 1-1. Микротом- устройство для получения гистологических срезов. Различают санные и ротационные микротомы. На рисунке – ротационный микротом. Блоки, содержащие кусочек органа, закрепляют в подвижном объектодержателе. При его опускании на ноже остаются серийные срезы, их снимают с ножа и монтируют на предметное стекло для последующей обработки и микроскопирования [83].
Рис. 1-1. Микротом- устройство для получения гистологических срезов. Различают санные и ротационные микротомы. На рисунке – ротационный микротом. Блоки, содержащие кусочек органа, закрепляют в подвижном объектодержателе. При его опускании на ноже остаются серийные срезы, их снимают с ножа и монтируют на предметное стекло для последующей обработки и микроскопирования [83].
позволяют получить срезы толщиной 1–5 мкм из материала, залитого в смолу. Приготовленные для последующей световой микроскопии срезы монтируют на предметное стекло.

Криостат. Если фиксация приводит к инактивации предполагаемых для изучения молекул (например, ферментов, биогенных аминов), используют криостат, позволяющий получить для СМ срезы толщиной 5–25 мкм в термически изолированной камере с низкой и регулируемой температурой.

Ультратом (ультрамикротом) позволяет получать срезы из материала, залитого в смолу. При помощи стеклянных или алмазных ножей готовят ультратонкие срезы толщиной от 0,08–0,1 (ЭМ) до 0,5 мкм (полутонкие срезы для СМ).

Вибротом. Для получения тонких срезов фиксированных и нефиксированных тканей без замораживания используют вибротом.


6

Замораживание–скалывание – подготовка материала к микроскопии методом криосколов.

Мазки и смывы готовят для микроскопии высушиванием на предметном стекле либо кратковременной фиксацией.

Окрашивание срезов и мазков

Перед окрашиванием срезы депарафинируют и доводят до воды в спиртах нисходящей крепости, после чего стекло со срезами помещают в водный раствор красителя. Клеточные структуры, как правило, не различимы даже при большом увеличении микроскопа, они бесцветны и прозрачны. Для выявления тканевых компонентов, отдельных клеток и клеточных структур с 50-х годов XIX века используют красители – лиганды с высоким сродством к различным компонентам ткани и с определёнными цветооптическими свойствами. Способность тканевых компонентов по-разному окрашиваться зависит от кислотно-основных (щелочных) свойств веществ, входящих в их состав. Для ЭМ материал контрастируют солями тяжёлых металлов, используют преимущественно цитрат свинца и уранилацетат.

Кислые красители (например, эозин, конгорот, разные оранжи) связываются со структурами или веществами, имеющими щелочную реакцию. Это – ацидофильные (основные) компоненты ткани (например, разные цитоплазматические белки [типичный пример – гемоглобин эритроцитов]).

Щелочные красители (например, гематоксилин, метиленовый синий, толуидиновый синий, азур) связываются с базофильными (кислыми) компонентами ткани (например, нуклеиновые кислоты ядра и рибосом).

Стандартные красители. Часто используют смеси кислых и щелочных красителей (например, гематоксилин + эозин). В гематологической практике мазки и срезы окрашивают специальными смесями (гематологические красители).

МИКРОСКОПИЯ

Световая микроскопия

Увеличение – физическое свойство линз объектива и окуляра. Увеличение микроскопа приблизительно оценивают как произведение увеличения объектива и увеличения окуляра (рис. 1-2).

Минимальный размер d наблюдаемого объекта определён формулой:


d =
0,61λ
nSinα
 ,

где: α – половина угловой ширины конуса световых лучей, собираемых линзами объектива; п – коэффициент преломления среды, отделяющей изучаемый объект от линз объектива или конденсора; λ – длина волны света. nSinα - апертура.

Разрешение микроскопа – величина, обратная d. Чем больше апертура, тем выше разрешение, но при этом уменьшается глубина резкости. Повысить разрешение можно за счёт увеличения апертуры. Увеличить апертуру можно путём увеличения коэффициента преломления. Коэффициент преломления жидких сред (иммерсионные среды) больше коэффициента преломления воздуха

7

Рис. 1-2. Микроскоп. Этот оптический прибор позволяет наблюдать мелкие объекты. Увеличение изображения достигается системой линз объектива и окуляра. Зеркало, конденсор и диафрагма направляют световой поток и регулируют освещение объекта. Механическая часть микроскопа включает: штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубус, тубусодержатель [83].
Рис. 1-2. Микроскоп. Этот оптический прибор позволяет наблюдать мелкие объекты. Увеличение изображения достигается системой линз объектива и окуляра. Зеркало, конденсор и диафрагма направляют световой поток и регулируют освещение объекта. Механическая часть микроскопа включает: штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубус, тубусодержатель [83].

(п = 1,0). В микроскопии используют несколько иммерсионных сред: масляную, глицериновую, водную.

Предел разрешения светового микроскопа определяется длиной световой волны и апертурой линз. Теоретически возможный предел разрешения светового микроскопа – 0,2 мкм (минимальное расстояние, на котором различимы два объекта).

Оптические артефакты. Объектив состоит из нескольких стеклянных линз. Первая линза – сферическая или полусферическая – предназначена для получения увеличенного изображения. Все остальные линзы корригируют оптические артефакты (аберрации).

Специальные виды микроскопии

Темнопольная. Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещённый на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии.

Поляризационная микроскопия – формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы).

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов. Специальная интерференционная оптика (оптика Номарского) нашла применение в микроскопах с дифференциальным интерференционным контрастом.

Люминесцентная микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два фильтра. Один фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Другой фильтр пропускает свет длины волны, излучаемой флюоресцирующим объектом. Таким образом, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра.

8

  • Катехоловые амины. Объект может флюоресцировать после специальной обработки ткани. Так, катехоламины, включая адреналин и норадреналин, флюоресцируют после обработки ткани в парах параформальдегида при 60–80 °С.
  • Флюоресцирующие красители (флюоресцеин, родамин и др.) избирательно связываются со специфическими макромолекулами.

Электронная микроскопия

Теоретически разрешение просвечивающего ЭМ составляет 0,002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0,1 нм. Для биологических объектов разрешение ЭМ на практике составляет 2 нм.

Просвечивающий электронный микроскоп состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны фокусируют, наблюдают на флюоресцирующем экране и регистрируют при помощи фотопластинки.

Сканирующий электронный микроскоп применяют для получения трёхмерного изображения поверхности исследуемого объекта.

  • Метод сколов (замораживание-скалывание) применяют для изучения внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем ЭМ.

Другие технологии визуализации биологических объектов

  • Компьютерная интерференционная микроскопия позволяет получить высококонтрастное изображение при наблюдении субклеточных структур.
  • Лазерная конфокальная микроскопия даёт возможность получить отчётливое изображение и наблюдать объекты в фокусе по всему полю. При сочетании с компьютерной техникой возможна пространственная реконструкция изучаемого объекта.
  • Рентгеновская микроскопия позволяет наблюдать объекты не в вакууме, а в обычных условиях.
  • Анализ изображений. Прогресс компьютерных технологий позволил автоматически обрабатывать и анализировать изображения клеточных и тканевых структур, быстро сосчитывать однотипные морфологические элементы, оценивать размеры клеток и субклеточных структур.

ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Гистохимические методы позволяют установить локализацию определённых веществ или биохимических процессов в тканевых и клеточных структурах. Для проведения гистохимической реакции обычно используют криостатные срезы, реже – срезы лиофилизированной ткани. О локализации исследуемого вещества судят по отложению окрашенного продукта реакции. Более

9

высокого разрешения добиваются в ЭМ (цитохимические методы). В этом случае применяют специальные методы подготовки объекта (криоультрамикротомия, замещение в замороженном состоянии, инертное обезвоживание и др.).

Гистохимия ферментов

В гистохимической практике ферменты подразделены на 6 главных классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы (синтетазы). В ходе стандартной гистоферментной реакции срезы ткани помещают в раствор субстрата и специального вещества, способного образовать конечный продукт реакции в виде окрашенного осадка. Следует исключить возможность инактивации фермента и диффузию конечного продукта реакции.

Ферменты-маркёры характерны для некоторых клеток и органелл: кислая фосфатаза – лизосомы, щелочная фосфатаза – эндотелий кровеносных капилляров, сукцинатдегидрогеназа (СДГ) и цитохромоксидаза – митохондрии, глюкозо-6-фосфатаза – эндоплазматическая сеть.

В таблице 1-1 приведена сводка наиболее распространённых методов идентификации разных веществ, а на рисунке 16 (см. вклейку) результаты гистохимического выявления активности АТФазы миозина и СДГ в разных типах скелетных мышечных волокон.

Иммуногистохимия

Принцип проведения иммуногистохимической реакции основан на специфическом взаимодействии меченых антител (AT) с тканевыми антигенами (Аг).

Таблица 1-1. Гистохимическое выявление разных веществ

Определяемое вещество Реакция или выявляющий реактив
Нуклеиновые кислоты Реакция Фёльгена (реактив Шиффа-фуксин)
  Акридиновый оранжевый (с ДНК флюоресценция жёлто-зелёного цвета, с РНК - красно-оранжевого)
  Щелочные красители (толуидиновый синий, метиленовый синий, гематоксилин)
Белки:  
     гистоны и протамины Прочный зелёный
  аминокислоты:  
     тирозин Реакция Миллона
     аргинин Реакция Сакагуши
  аминогруппы Нафтоловый жёлтый
Углеводы:  
     поли- и олигосахариды Реакция Шиффа с периодной кислотой
     полисахариды Рутениевый красный
     гликозаминогликаны Альциановый синий
     α-D-глюкоза и Конканавалин А
     α-D-манноза  
     N-ацетилглюкозамин Агглютинин из зародышей пшеницы
     Фукоза Пектин из семян лотоса
     α-галактоза Агглютинин земляного ореха, лектин из сои
Липиды Проционовый жёлтый, суданы

10

AT метят различными способами: флюорохромами (флюоресцеин, родамин и др.), при помощи ферментной реакции (пероксидаза хрена) или электроноплотными частицами (ферритин, коллоидное золото). Применяют два варианта иммуногистохимических реакций: прямой (рис. 1-3, А) и непрямой (рис. 1-3, Б). В качестве примеров смотрите микрофотографии на вклейке, на которых представлены результаты избирательного выявления ядрышек в клетках культуры (рис. 2), гонадотрофина в плаценте (рис. 7) париетальных клеток в слизистой оболочке желудка (рис. 43), инсулина и глюкагона в островках Лангерханса (рис. 48), Аг базальной мембраны капиллярных клубочков почки (рис. 54), нефрина – компонента фильтрационного барьера почечных телец (рис. 55). При использовании двойной метки (разные AT, конъюгированные с различными флюорохромами) можно наблюдать на одном срезе взаимное расположение разных структур; так, на рисунке 3 (см. вклейку) показаны и митохондрии, и микротрубочки.

Гибридизация in situ

В ходе дифференцировки клеток координированно включаются и выключаются большие группы генов. Гибридизация одноцепочечной молекулы ДНК (ДНК-зонд) с комплементарной клеточной РНК позволяет ответить на вопрос, происходит или нет экспрессия определённого гена, и установить уровень, на котором она может меняться, – транскрипция ДНК, сплайсинг РНК, трансляция. Метод гибридизации in situ позволяет выявить нужные последовательности ДНК или РНК. Последовательности нуклеиновых кислот, связанные с меткой (радиоактивный 32Р; биотин, характеризующийся высоким сродством к авидину), находят комплементарную последовательность в клетке.

Рис. 1-3. Иммуноцитохимическая реакция. А. Прямой метод предполагает использование меченых AT против интересующего Аг. AT взаимодействуют с Аг в местах их локализации. Эти места выявляют при помощи метки, связанной с AT. Б. Непрямой метод предполагает использование двух различных AT. Первые AT реагируют с Аг ткани. Связанные с меткой вторые AT специфически взаимодействуют с первыми AT, которые для вторых AT являются Аг. Метод значительно чувствительнее прямого, т.к. с каждой молекулой первых AT связывается несколько молекул вторых AT, содержащих метку (например, пероксидазу) [76].
Рис. 1-3. Иммуноцитохимическая реакция. А. Прямой метод предполагает использование меченых AT против интересующего Аг. AT взаимодействуют с Аг в местах их локализации. Эти места выявляют при помощи метки, связанной с AT. Б. Непрямой метод предполагает использование двух различных AT. Первые AT реагируют с Аг ткани. Связанные с меткой вторые AT специфически взаимодействуют с первыми AT, которые для вторых AT являются Аг. Метод значительно чувствительнее прямого, т.к. с каждой молекулой первых AT связывается несколько молекул вторых AT, содержащих метку (например, пероксидазу) [76].

11

Таким образом, метод гибридизации in situ даёт возможность изучать локализацию генов (см. рис. 1 на вклейке) и их экспрессию.

КЛЕТОЧНАЯ, ТКАНЕВАЯ И ОРГАННАЯ КУЛЬТУРЫ

Методы культивирования применяют для исследования функции изолированных живых клеток и тканей вне влияния регуляторных механизмов целостного организма. Следует помнить, что ситуации in vivo и in vitro не идентичны, клетки и ткани проявляют в этих состояниях различные свойства и по-разному реагируют на одинаковые воздействия.

Клеточная культура

Клеточная культура содержит суспензию клеток или клетки, прикрепившиеся к субстрату. Культивирование проводят в стеклянной или пластиковой посуде, поверхность которой предварительно покрывают желатином, полилизином, коллагеном и другими компонентами внеклеточного матрикса. Культивируемые клетки формируют монослой или отдельные клеточные колонии – клоны. Культивирование проводят в атмосфере строго определённого газового состава в специальном устройстве – СО2-инкубаторе. Питательная среда для культивирования содержит аминокислоты, витамины, гормоны, факторы роста, углеводы, антибактериальные и антигрибковые препараты и другие добавки на буферном изотоническом солевом растворе.

Получение клеточных культур. Кусочки ткани измельчают, обрабатывают гидролитическими ферментами (трипсин, коллагеназа, гиалуронидаза и др.), после чего клетки могут быть разделены в зависимости от их размеров и массы путём центрифугирования. Для сортировки клеток используют помеченные флюоресцирующими веществами AT, которые избирательно связываются с Аг, специфичными для определённых клеточных типов. Используемое для этой цели устройство называют сортер.

Клеточная линия. Клетки, полученные для культивирования из ткани или органа, сначала составляют небольшую популяцию – первичная культура. При длительном культивировании и многочисленных пересевах из первичной культуры может быть получена клеточная линия – клетки, способные многократно размножаться. Линии трансформированных клеток неопределённо долго хранятся в жидком азоте, их в любое время можно использовать для получения клеточных культур и проведения различных исследований.

Тканевая и органная культуры

Культивируют фрагменты тканей или органов. Метод часто используют для исследования механизмов эмбриональной дифференцировки и морфогенеза.

ЦИТОФОТОМЕТРИЯ

Метод цитофотометрии предназначен для количественного определения различных веществ и их локализации в клетке по характеристическому

12

поглощению этими веществами света определённого спектра. Цитофотометрию проводят в ультрафиолетовом, видимом, инфракрасном, рентгеновском диапазонах и применяют для определения количества нуклеиновых кислот, белка, активности ряда ферментов, поэлементного анализа химического состава клеток. Чувствительность метода – 10-12 г, что на несколько порядков выше чувствительности микрохимических методов исследования.

РАДИОАВТОГРАФИЯ

Метод позволяет судить о синтезе различных макромолекул в субклеточных структурах (табл. 1-2). В среду обитания клеток in vivo или in vitro вводят радиоактивный предшественник синтеза макромолекул. Радиоактивность поглотившей метку структуры регистрируют по восстановлению зёрен серебра в покрывающей препарат фотоэмульсии.

Таблица 1-2. Радиоавтографическое выявление некоторых веществ

Определяемое вещество Изотоп и предшественник
ДНК 3Н-тимидин, 14С-тимидин
РНК 3Н-уридин, 3Н-цитидин
Белок 35S-меченные аминокислоты

МАРКЁРЫ

Каждый клеточный тип и его фенотипы характеризуются экспрессией конкретных генов, в большинстве случаев различных между разными клеточными типами. Идентификация специфических для них признаков – маркёров – позволяет определить наличие конкретного клеточного типа (или фенотипов клеточного типа). Это обстоятельство широко используют в медицине (в т.ч. в онкологии) для диагностики разных заболеваний (маркёры хромосомные, иммунные, опухолевые, ферментные и т.д.).

В экспериментальной и клинической практике нашли применение т.н. кластеры дифференцировки (CD-маркёры, см. Приложение 2), мутантные линии животных (модели болезней человека), клонированные гены (нормальные и патологические аллели) и полипептиды – продукты их экспрессии.

13


На главную
Комментарии
Войти
Регистрация
Status: 408 Request Timeout